众所周知，在反相液相色谱中，固定相是非极性的，而流动相是极性的。我们如何使流动相呈极性呢？通过添加水这样的水性组分。然而，添加水的比例有限制，不能使用含水量过高的流动相进行反相液相色谱分析，如90%、95%甚至100%。那么，这是什么原因呢？
首先，我们需要了解为什么要使用高含水量的流动相。原因可能是为了保留高极性分子，如有机酸。例如抗坏血酸，这些分子在性质上是高极性的，它们在反相液相色谱中不会被充分保留，因为我们的固定相是非极性的，而非极性固定相不会保留这些极性化合物。因此，需要在流动相中添加高比例的水相。这是因为水是一种极性溶剂，它能够与极性较强的分析物形成氢键或离子相互作用，从而降低分析物在流动相中的溶解度，有利于分析物在色谱柱上的保留和分离。
接下来，我们需要了解c8或c18固定相的性质。c8/c18是一种常用的反相液相色谱柱，其表面键合有c8或c18烷基链，具有类似油脂的非极性特性。在反相色谱法中，分析物在流动相和固定相之间进行分配，以实现分离。由于c8/c18柱的固定相非极性，它们通常适用于分析非极性或弱极性分析物。然而，油水不能混合，类似油脂的非极性特性使得c8或c18固定相在高比例水相中不能被润湿。当流动相中有一定比例的有机溶剂，如乙腈或甲醇（其性质为非极性）时，对c8或c18具有良好的润湿性。而键合的固定相是位于硅胶孔内的，这意味流动相能够润湿c8或c18固定相的孔。这一点是非常重要的，否则它们将无法实现对目标分析物的保留。然而，如果使用100%的水相作为流动相，这会使c8或c18键合固定相干涸。因为水具有较高的表面张力，流经固定相的水分子不会进入孔内，而只会通过孔之间的空间。这样一来，孔就不会打开，如果孔没有被润湿，那么固定相无法处于活跃状态，不能与分析物发生相互作用。这就是在反相液相色谱中使用c8/c18柱时要避免高水相流动相的原因。
当c8/c18固定相暴露在高水相流动相中时，由于表面张力较高，c8/c18表面会脱水，这种现象称为固定相塌陷、链折叠或固定相打结，化合物无法正常地与固定相发生相互作用进行保留。
那么，固定相塌陷会带来哪些问题呢？固定相塌陷可能会导致保留减少、保留时间的不重复的现象。并且如果想再次从干涸状态恢复到润湿状态，这个反向过程将需要很长的时间。保留的减少是因为键合固定相的活性表面存在于硅胶孔中，而孔内没有被润湿，化合物也无法进入孔内与其发生相互作用。因此，保留时间会减少。例如，如果使用90%的水和10%的甲醇作为流动相，保留时间为10分钟。此时，如果只使用100%的水，10分钟的保留时间会急剧减少到3~4分钟。第二个重要的点是保留时间的重复性会降低，可能会随着时间的推移而发生变化。所以，如果保留时间变化很大，可能是因为流动相中水含量较高。
如果别无选择，只能使用水性或高比例水相的流动相，那么在方法开发阶段，需要注意选择合适的色谱柱。
1.未封端色谱柱。未封端柱表面存在较多的具有一定极性的游离硅醇，游离硅醇使固定相表面能被润湿，有利于极性分析物的保留。
2.短链烷基色谱柱：键合链之间存在游离体积，硅醇的屏蔽作用很小，有利于极性分析物的分离。
3.极性嵌入烷基相色谱柱：在烷基链中嵌入极性基团，增强与极性分析物之间的相互作用，提高保留性能。
4.宽孔径相色谱柱：以便水可以渗透到孔内使相湿润，有利于极性分析物在高水相流动相下的保留。
综上所述，在使用c8/c18色谱柱时，应避免高水相流动相，以免造成固定相塌陷等问题。针对高水相流动相下保留极性分析物的需求，可以选择其他类型的色谱柱进行分析。
